黃原膠降解酶生產(chǎn)條件的優(yōu)化,新分離Microbacfcrium sp XT11菌能夠合成黃原肢降解酶，將植物病原菌野油菜黃單孢菌分泌的毒 素因子黃原肢分解，生成具有激發(fā)子和抗微生物活性的黃原肢寡糖。實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，黃原肢和酵母浸粉分別是XT11菌 生產(chǎn)黃原肢降解酶的最適碳源和氮源，荻得最高酶活力的最低碳源和氮源濃度均為0 3%。XT11菌生產(chǎn)黃原肢降 解酶的最適條件為：培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)基起始陽(yáng)7. Q轉(zhuǎn)速150r/mii。
化學(xué)農(nóng)藥以快速有效和價(jià)格低廉在農(nóng)業(yè)増產(chǎn)保 收中發(fā)揮了巨大作用，但頻繁而不加區(qū)分地隨意施 用也引發(fā)了生態(tài)環(huán)境污染和藥物殘留等危害人類(lèi)健 康的嚴(yán)重問(wèn)題[1]。因此，很多化學(xué)農(nóng)藥己逐漸被禁 止使用。寡糖作為生物農(nóng)藥具有對(duì)人類(lèi)和生態(tài)環(huán)境 無(wú)害、不易產(chǎn)生抗藥性、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，已成為 生物農(nóng)藥的發(fā)展方向。人76^等[2]首先發(fā)現(xiàn)病原菌 大雄疫霉細(xì)胞壁碎片中的寡糖能夠誘導(dǎo)植物合成植 保素，抵御植物病原菌的侵染[3]。寡糖也能夠控制 植物病原菌感染，具有抗微生物活性[4]。目前己成 功研究的活性寡糖主要包括0-葡聚糖寡糖、幾丁 質(zhì)脫乙酰幾丁質(zhì)寡糖、果膠質(zhì)寡糖和木葡聚糖衍生 的寡糖等，黃原膠降解酶生產(chǎn)條件的優(yōu)化,但所有這些寡糖都是從病原菌或植物細(xì) 胞壁的結(jié)構(gòu)多糖中分離出來(lái)的[5]。黃原膠是由植 物病原菌野油菜黃單孢菌分泌的一種胞外多糖，與 這些細(xì)胞壁多糖具有相似的結(jié)構(gòu)特征[6]，推測(cè)黃原 膠降解物也可能有類(lèi)似的生理功能[7]。
從土壤中得到的一株黃原膠降解菌M ^obacfc- nun sp XT11，能夠降解黃原膠分子[8]。所形成的 黃原膠寡糖具有激發(fā)子活性，誘導(dǎo)植物的自我防御 響應(yīng)[9]。同時(shí)也具有抗微生物活性，抑制野油菜黃
單孢菌的生長(zhǎng)并阻止黃原膠分泌[1〇]。更有意義的 是，黃原膠是野油菜黃單孢菌引起植物黑腐病的毒 素因子[11],而黃原膠降解產(chǎn)物卻對(duì)黃原膠生產(chǎn)菌有 抗菌活性[1〇]。這是繼細(xì)胞壁多糖降解物被證明具 有生物活性后,我們首次報(bào)道植物病原菌毒素因子 的降解物也同樣具有生物活性[7]。研究結(jié)果表明， 黃原膠寡糖在植物黑腐病防治中是一種潛在有價(jià)值 的生物控制劑[10],本文將主要研究XT11菌合成黃 原膠降解酶的生產(chǎn)條件優(yōu)化及影響因素。
2材料與方法
2 1黃原膠降解菌與培養(yǎng)方法
黃原膠降解菌M icrobacteriUm sp XT 11由本實(shí) 驗(yàn)室從土壤中分離純化并保存。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成：250mg CaCl, 250 mg K2HPO4, 400mgNaC! 125mgMgS〇4, 350mgKN〇3, PH7 0 1 000ml蒸餾水。
種子培養(yǎng)基組成：2g黃原膠，1g葡萄糖，0 5 g 酵母浸粉，1 000 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
生產(chǎn)培養(yǎng)基組成：3g黃原膠，2g酵母浸粉，1 000ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
培養(yǎng)方法:挑取一環(huán)新鮮斜面保存菌種,接種于 種子培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)（150 r/min)約9h使 OD600接近0 8后，按2%接種量接種黃原膠降解 菌于液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速為150 r/ min)，分別在18^24和30h取樣測(cè)定發(fā)酵液的菌體 濃度和上清液中的黃原膠降解酶活力。
2 2分析方法
菌體濃度采用濁度法測(cè)定，并用600 nm處的光 吸收表示；還原糖濃度按Milfer[12]描述的方法，取
02ml待測(cè)溶液與等體積的3 5二硝基水楊酸試 劑混和后，于沸水浴中加熱5m in立即冷卻，補(bǔ)水至
15ml在520納米處測(cè)定吸光度值;粘度采用黃原 膠溶液在移液管中的沉降速度表示，取一支0 2 ml 的移液管吸取待測(cè)溶液至滿(mǎn)刻度，記錄溶液由0刻 度下降到0 1m該U度所需要的時(shí)間，并以時(shí)間“秒” 為粘度計(jì)量單位。
23黃原膠降解酶活力測(cè)定
將0. 4ml發(fā)酵上清液與等體積溶于100 mM磷 酸緩沖溶液（pH 7 0)的0 5%黃原膠溶液混合后， 應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液粘度t。將發(fā)酵上清液沸水浴中煮 沸5m n使酶失活，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)并記錄為t)，兩次 實(shí)驗(yàn)的粘度差值A(chǔ)t= tc-l!用于計(jì)算酶活力。
酶活力單位定義為:在上述酶反應(yīng)條件下，使黃 原膠溶液的粘度每下降一個(gè)粘度單位所需要的酶量 為一個(gè)酶活力單位（U)。
3結(jié)果與討論
31碳源對(duì)黃原膠降解酶生產(chǎn)的影響
用終濃度為0 5%的不同碳源分別代替生產(chǎn)培 養(yǎng)基中的黃原膠，黃原膠降解酶生產(chǎn)條件的優(yōu)化,培養(yǎng)黃原膠降解菌XT11測(cè)定培 養(yǎng)液中的黃原膠降解酶活性，所研究的碳源包括葡 萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、黃原膠、蔗糖、乳糖、羧甲 基纖維素、乙醇、甘露糖、甘露醇、瓊脂（0 3%)和海 藻酸鈉。不同碳源培養(yǎng)基中XT11菌生產(chǎn)的最大黃 原膠降解酶活力如圖1所示。以黃原膠為碳源時(shí)發(fā) 酵上清液中的黃原膠降解酶活力最高，在海藻酸鈉 和瓊脂為碳源的培養(yǎng)基中也能夠檢測(cè)到黃原膠降解 酶活性，但以葡萄糖、麥芽糖或蔗糖為碳源培養(yǎng) XT11菌時(shí)則完全不產(chǎn)黃原膠降解酶。
當(dāng)以黃原膠為碳源由XT11菌生產(chǎn)黃原膠降解 酶時(shí)，黃原膠濃度不同,所合成的黃原膠降解酶量也 不相同。當(dāng)黃原膠濃度為0 3%時(shí),黃原膠降解酶 活力達(dá)到最大，再增加碳源濃度對(duì)黃原膠降解酶生 產(chǎn)的影響可以忽略。
3 2氮源對(duì)XT11菌產(chǎn)酶的影響
于40°C水浴中反應(yīng)40min沸水浴加熱5m in終止反bl白胨、甘氨酸、牛肉膏、尿素、硝酸銨、磷酸氫二銨和
用不同的氮源（終濃度為0 2% )代替生產(chǎn)培養(yǎng) 基中的酵母浸粉,分別研究不同氮源如蛋白胨、胰蛋
硫酸銨等對(duì)黃原膠降解酶生產(chǎn)的影響，結(jié)果如圖2 所示。由圖中結(jié)果可知，當(dāng)以酵母浸粉為氮源時(shí)， XT11菌的黃原膠降解酶生產(chǎn)能力最大。而在以蛋 白胨、磷酸氫二銨或硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中則完 全不產(chǎn)黃原膠降解酶。
在以酵母浸粉做生產(chǎn)培養(yǎng)基中的氮源時(shí)，分別 考察了酵母浸粉不同濃度對(duì)黃原膠降解酶生產(chǎn)的影 響。當(dāng)酵母浸粉濃度為0 3%時(shí)，培養(yǎng)液中的黃原 膠降解酶活力達(dá)到最高值,繼續(xù)提高氮源濃度時(shí)，黃 原膠降解酶活力幾乎沒(méi)有任何變化。
3 3培養(yǎng)溫度與黃原膠降解酶生產(chǎn)的關(guān)系
將XT11菌接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基中，分別于不同 溫度條件下培養(yǎng)，考查發(fā)酵溫度對(duì)黃原膠降解酶生 產(chǎn)的影響。正如圖3中結(jié)果，在所測(cè)定的培養(yǎng)溫度 范圍內(nèi)（20?36°C)，溫度對(duì)XT11菌的黃原膠降解 酶生產(chǎn)沒(méi)有明顯影響，其中以28°C培養(yǎng)時(shí)，黃原膠 降解酶產(chǎn)量最大。
3 4溶氧對(duì)XT11菌產(chǎn)酶能力的影響
在250m啲三角瓶中加入60ml生產(chǎn)培養(yǎng)基，接 菌后于30°C搖床內(nèi)，黃原膠降解酶生產(chǎn)條件的優(yōu)化,分別采用不同的轉(zhuǎn)速培養(yǎng) XT11菌，檢測(cè)溶氧條件對(duì)黃原膠降解酶生產(chǎn)的影 響，結(jié)果如圖4所示。搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)黃原膠降解酶的 生產(chǎn)并沒(méi)有十分明顯的影響，轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí) 的黃原膠降解酶生產(chǎn)比最高酶活力時(shí)低不到20%。
35培養(yǎng)基初始pH對(duì)黃原膠降解酶生產(chǎn)的影響 將生產(chǎn)培養(yǎng)基的洱值分別調(diào)到5 (、5 乂6 a 6 乂 7 0和7 5后接菌培養(yǎng)，以考察不同初始pH值 與黃原膠降解酶生產(chǎn)的相互關(guān)系。由圖5結(jié)果可以 看出，當(dāng)洱低于6 5時(shí)，XT11菌合成黃原膠降解 酶的能力隨pH的升高而增加，當(dāng)初始pH值達(dá)到 6 5?7 5時(shí)酶生產(chǎn)能力為最大。
36黃原膠降解酶生產(chǎn)曲線(xiàn)
根據(jù)上述影響M icrobacterium sp XT 11菌生產(chǎn) 黃原膠降解酶因素的研究，可以確定XT11菌較好 的酶生產(chǎn)培養(yǎng)基應(yīng)該是含有0. 3%黃原膠和0. 3% 酵母浸粉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（pH7. 0)。
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