黃原膠發酵動力學的研究,黃原膠是由野生黃單胞菌以碳水化合物為主要 底物，經發酵產生的一種酸性胞外雜多糖[11。
黃原膠分子的基本構成為D-葡萄糖、D-甘露 糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸以及丙酮酸w。黃原膠發酵動力學的研究,其中前三者 的比率接近3: 3: 21”。從其分子結構可以看出,主鏈與 纖維素基本相同，其顯著差別僅在于三糖側鏈在無水 葡萄糖單位之間交替出現。每兩個經由P - 1，4 - D -
糖苷鍵連接而成的葡萄糖分子上，含有一條由一個 D-葡萄糖醛酸連接兩個D-H•露糖組成的側鏈，上 面連接有乙酰基和丙酮酸鹽
由于黃原膠具存的獨特結構141和優良性能15 61,所 以被廣泛應用于多種行業中國內外針對黃原膠 研究的工作主要集中在菌種選育、培養基、發酵條件、 基因X程菌構建等諸多方面，f曰.有關發酵動力學的研 究仍少見報道，特別是國內在這一方曲未曾涉足„
發酵動力學研究發酵過程變量在活細胞的作用 下變化的規律，黃原膠發酵動力學的研究,以及各種發酵條件對這些變量變化速 度的影響。在黃原膠發酵動力學的研究中，我們主要 從兩個方面進行，即菌體生長動力學和產物合成動力 學。擬通過對這兩個過程中微生物比生長速率、基質 消耗率、產物合成率、維持系數等動態變量之關系以 及它們與發酵條件之間關系的研究，從而更加系統、 有效地駕馭這些發酵條件和動態變量，實現發酵過程 中的動力學問題進行了探索性研究，該項基礎研究可
用于提卨我國當前黃原膠丁業化生產過程的控制 水平；為改善我國生產的現有黃原膠質量提供了T.程 動力學的調控依據。同時，也為我們后續的基因工程 的黃原膠生物合成代謝譜圖及生產工藝放大的研究 奠定了理論基礎。
1材料與方法
1.1材料 1. 1.1菌種
Xanthonomas campestris一9002,由本研究室保藏 菌種選育 1.1.2培養基
1.1.2. 1斜面培養基(％)
葡萄糖1.0,蛋白胨1.0,牛肉膏0.15,酵母浸出物
0.3.瓊脂2.0,pH7.0。
1.1.2.2種子培養基(％)
葡萄糖1.0,蛋白胨0.5,酵母浸出物0.3,牛肉膏
0.3,硫酸鎂0.01,磷酸氫二鉀0.05,碳酸鈉0.2, PH7,0:
1. 1.2.3發酵培養基(％)
葡萄糖1.0,淀粉3.0,蛋白胨0.3,酵母浸出物 0. 3，氯化鉀0. 5,磷酸氫二鉀0. 41,硫酸鎂0.01,磷酸 二氫鉀 0.069,抒檬酸 0.2,PH7.03 1.2方法
1.2.1搖瓶發酵試驗
按常規細菌學方法制備種子菌液，以10%的體積 比接人發酵培養基中，并將發酵培養基的最終體積控 制在100ml,裝人500ml的二角瓶中，置往復式搖床， 發酵6011(23〇1?111,28尤）(：每個樣品設三個重復。 1.2.2發酵罐發酵試驗
種子液制備同搖瓶發酵試驗。裝液量5000ml,接 種量10%,通氣量0.6L/min，轉速250/min,溫度 28 ~3(«：,發酵周期60h,取樣間隔4h,PH7.0。檢測參 數:轉速、溫度、粘度、殘糖、pH和產膠率3 1.2.3恒化培養
培養基配方同分批培養。恒化培養開始前，先進 行分批培養。培養基經接種后讓菌體生長繁殖到一定 的濃度，發酵液粘度達到lOOOOcps以上時，開啟蠕動 泵，以某一恒定速率補料，并連續流出樣液，保持發酵 罐內液面恒定：當達到穩定狀態時，測定各狀態參數, 調大流速進行下一組試驗。培養條件:28 ± 1^ ,35〇" min,通氣量 0. 6L/minn
恒化培養試驗裝置如圖2所示。試驗通過進料口
處的兩只蠕動泵來調控補料流量，連續從取料n取 料，以維持罐內發酵液體積為一恒定值。
1.2.4發酵液PH值的測定
用PHs -25型PH計直接測定發酵液的pH值。
1.2.5發酵液殘糖的半定置測定
產）
1.2.6發酵液粘度的測定
取發酵液直接用上海天平儀器廠生產的- I 型旋轉粘度計以叫號轉了• 6r/min測定，ffl所得數據 乘以1000即為發酵液粘度5 1.2.7發酵液吸光度的測定
取發酵液稀釋后直接用72〖型分光光度計在 650nm波長下測定其吸光度。
1.2,8產膠率的測定
定量稱取發酵液，下業酒精沉降.50T烘至恒 1。稱最干膠重量，黃原膠發酵動力學的研究,干膠重1與發酵液重量的比即為 產膠率。
1,2,9發酵液殘糖的定量測定(3,5—二硝基水楊酸 比色定搪法)丨18]
1,2.10細胞干重的測定
定量吸取發酵液，適當稀釋后用事先烘干的濾紙 在大漏斗中過濾，將濾紙置于50?烘箱中烘至恒 重，稱重后換算成所需單位。
2結果與討論
2.1黃原膠分批發酵特性 2.1.1菌體生長曲線
圖3為黃原膠分批發酵過程中發酵液吸光度隨 時間的變化規律，發酵液吸光度的變化可看作是其中 菌體量的變化，故吸光度隨時間的變化曲線可看作菌 體生長曲線，體現發酵過程中菌體的生長情況。從生 長曲線來看，菌體的對數增長期為發酵開始12至 20h，在這一時間內，菌體生長速度最快jOh以后進人
發酵時間[h)
®4黃原膠發酵過程中PH的變化曲線
穩定期，曲線呈平緩趨勢,菌體生長兒乎停止。20h后表1。 達到穩定期是因為培養液中菌體繁殖達到平衡。
2.1.2 pH的變化
圖4為黃原膠分批發酵過程中pH隨發酵時間的 變化曲線3從曲線可看出，在發酵的初始階段PH值有 一較小的上升，這是因為發酵液中的一些金屬鹽類及 酸根離子所具有的緩沖作用。之后，因產物合成產酸， pH下降，直至穩定期開始，菌體生長緩慢，pH兒乎不 再發生變化。
于新鮮培養基的加人造成局部濃度現象的發生=發酵 罐的工作體積確定為8L(其裝量系數為〇. 625)「綜合 工藝要求，選擇攪拌轉速為35〇r/min，培養溫度為 通氣童〇. ^L/min。連續培養補料葡萄糖溶 液濃度為30g/L„
2.3恒化培養穩定狀態的確定
根據發酵液粘度及pH的變化進行判斷，當粘度 和pH在一較長時間內維持穩定時，間隔〗~ 2h取樣 測其粘度，并觀察pH變化，若2 - 3次無變化或變化 很小，即認為系統已達穩定狀態。
2. 4連續培養試驗結果
按上述實驗條件和要求，以葡萄搪作為限制性基 質進行連續培養先進行分批培養，并在24h以相對 于發酵液1%的量補加葡萄糖一次。當發酵液粘度升 至]8500cps時開始連續培養。稀釋率試驗范圍為 0.03-0. 08h_\當每改變一次稀釋率，進人穩態后分 別取樣測定殘糖、菌濃、粘度和產膠率。試驗結果列于
由表1可見，菌濃、產率、粘度、pH均隨稀釋率增 大而降低。這是因為發酵液濃度變稀所致。不同稀釋 率下的各參數計算值見表
表1恒化培養試驗數據
稀釋速率D/(f)菌濃(g/L)殘糖(g/L)粘度{cps)pH產率(％)
0.0335.27. 830139006.352.36
0.0432.611.1188006,051.54
0- 0530.214.7053005.901.46
0.0627,019-0138005.861-22
a 〇819.831.2535005-911.12
表2不同稀釋速率下各參數的計算值
rnh-1)Yc(g/g)DX(g/L h)Qo^g/g. h)
0.030. 02741.0941.06a 0020
0,040. 0354L 1281.300.0021
0.050.04191. 1941.510.0024
0.060. 04661,2861.620. 0027
0.080.03542. 2631.580. 0045
其中；Qr. = D(S。- S)/X為底物葡萄糖比消耗速率.g/f；. h; Yc =- S),為基質得率系數,以以D/X,為黃質K比生成速
率j/g；. h;DX為菌灃生長速軋g/L上
2.2培養條件的確定所致。
恒化培養要求發酵罐內培養液混合均勻，防止由2.5—9902生長模型的建立
由表2可知，隨著稀釋率的增加，基質得率和 產物比生成速率都呈上升趨勢，黃原膠發酵動力學的研究,這說明連續補料可 提高基質得率，促進產物生成。而底物比消耗速率 和菌體生長速率均增加到一定程度后有所下降，這 是由于體系被稀釋一定程度后菌體生長平衡被打破
0 111''
0.030.040.050.060.08
稀釋率(1/h)
+殘.+茴濃+產率一•_粘度
圖，不同玀釋速率T的穩態蒗濃、產膠率、殘糖、粘度
及發酵動力學特性參數的推導
圖5顯示野油菜黃單胞菌連續培養達穩態時菌 體濃度、黃原膠產率、發酵液粘度、殘糖含量隨稀 釋速率D的變化關系，從圖中可以看出，隨D的提 高，菌體濃度、發酵液粘度和產率均下降。由于葡 萄糖料液流人體系后有三個流向，一為菌體生長消 耗，二為產物合成消耗，其余隨發酵液流出。故葡 萄糖料液的不斷補加使體系稀釋，上述參數下降， 殘糖含量增加。
已知 Monod 方程S/(fe+S)⑴
變形得 1/(1 = 1/和„ + Ks/p™,. 1/S⑵
穩態時P = D,故l/)x可以1/D來代替。
由圖2-4可見l/>ftl/S成直線關系，說明野 油菜黃單胞菌的生長與限制性基質濃度的關系符合 Mum>d方程。根據連續培養試驗結果，用計算機對1/ M•和i/s進行最小二乘回歸，求得jw=o. ism-1, L = 41. 32g/L(其相關系數 R = 0. 9995)。
在連續培養中，對底物葡萄糖進行物料衡算，可 以得到基質的比消耗速率與菌的比生長速率^最 大生長得率系數Yc™'和維持系數m的關系式如下：
Q& = II/YG0"1 + tn(3)
拫據式(3),通過計算機對和p進行線性回歸 |由于稀釋率為a 〇8時體系已被破壞，故作圖時舍去 該點），求得 YGm!U = 1. 560g/g 和 m = 0. 009g。
2.6服咖,? c£iwi/)€sfris—9902 比生長速率對菌
體產率的影響
由Mnnod方程變形得3口皡,,/(卜-^)(4)
因「) = [1，所以 S = DKV(p^-D)(5)
g0.5 .
〇11111
00.020.040.060.089,1
K-ll/h).
囝7比生長速率叫與菌體產串DX的關系
穩態時，對限制性養分葡萄糖進行物料平衡可求
得
X = Y(SU-S)(6)
將式5代人式6得
X = YX/5[S〇-DK5/(JI„„-D)](7)
故
DX=DY1/5|S〇-DK5/((j..„-D)l(S!
為求得DX達到最大值時的D
d(DX)/dD=0(9)
解方程(8)和(9),并假設Y.x/S不受D的影響，則 D = D. = )L.„[I - (K./fKs + So))1'-'](10)
將（!■_=0. 18901T1，K,=4].32s/I.，S〇=40g/L 代人式(10)得最適理論稀釋速率D„ = 0. 05428h -1。
圖7為DX隨A而變化的曲線，曲線呈鐘罩形，由 計算所得最佳理論稀釋速率與曲線峰值逼近，黃原膠發酵動力學的研究,說明理 論值與試驗結果相符3曲線與橫坐標D為0時的交點 0. 1684和計算所得最大比生長速率0. ]890較為接 近，進一步證明了試驗的正確性
3結論
通過對黃原膠發酵動力學的研究.得知分批發 酵過程中菌體對數增長期為12~20h PH隨發酵時 間先小幅度增加，后下降，對數增長期后平緩。1/|X 與1/S符合Momjd方程，得出最大比牛長速率 (x„„=0. I890h'飽和常數K.=4〖.32g/L,基質得
率系數二〇, 〇62g/g，維持系數m = 0」543g/ g,h,最佳理論稀釋速率Dtn=0,0M28h_1。隨稀釋 速率增加，粘度、菌濃、產膠率下降，殘糖上升。
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