黃原膠補料分批發酵工藝的試驗研究，黃原膠（xanthan gum),又稱漢生膠，是野油菜黃 單胞菌（lafltAcrnoflas ca即estris)以碳水化合物為主要原料，經發酵生產的一種用途廣泛的微生物胞外多糖。黃 原膠分子由D-葡萄糖D-甘露糖，D-葡萄糖醛酸、乙 酸和丙酮酸構成，經發酵提取后得到的成品為白色或淺 米黃色粉末。它無味、無臭、無毒、食用安全，是 目前國際上集增稠、懸浮、乳化、穩定于一體，性 能最優越的生物膠。黃原膠補料分批發酵工藝的試驗研究，因其具有獨特的性質而被廣泛地應 用于食品、醫藥、造紙、紡織、陶瓷、日化用品、 石油開采等2 0多個行業，被譽稱為“工業味精”a I 目前，黃原膠的工業生產均采用間歇分批發酵的工 藝，即一次性投料，一次性出料。在整個發酵過程中， 隨著黃原膠的積累，發酵液的粘度會迅速增加，對發 酵結果造成許多不利的影響，如：溶解氧限制、發酵 產品質量低、產膠率低等。為此，人們從新設備、新 工藝方面開展了大量地研究，來克服這些負面的影響[>4]。 本文嘗試采用分批補料的發酵工藝來改善間歇發酵工藝

的不足，以期望來提高發酵的最終結果。

1 材料與方法 1.1 材料

出發菌株：野油菜黃單胞菌（t/j on 〇 c a s caiupesti'is) QH79，由鄭州大學生化工程中心選育。

培養基：

種子培養基：蔗糖1%，蛋白胨0.5%,牛肉膏0. 3%, NaC10.5%, pH 7.0；

發酵培養基：適量淀粉水解液（見試驗結果），蛋白 胨0.3%，豆餅粉0.2%，碳酸f丐0.3%，檸檬酸0.1%, pH7.0;

補料培養基：3.20%淀粉水解液，口117.0;13.20% 淀粉水解液，蛋白胨0.05%，pH7.0; c. 20%淀粉水解液， 蛋白胨 0. 1%, pH7. 0。

12 分析方法[5]

總糖的測定斐林法菌體濃度測定 凱氏定氮法；粘度測定 NDJ — 1型粘度計，4號轉子，3 0

轉，室溫下測定；產膠率測定酒精沉淀法。

1.3 培養方法

斜面菌種活化后，接種于種子培養基中，2 8 °C培 養16h后，以5%的接種量接種于發酵培養基中，28°C 培養3d。在發酵培養過程中進行補料試驗，具體結果 見結果與討論。

2 結果與討論

2.1 發酵培養基DE值的影響

通過前期的試驗研究，考察了碳源、氮源、無機 鹽和pH等因素的影響，確定了間歇發酵的最適培養基 [5]。在試驗過程中，發現在淀粉、蔗糖、葡萄糖三種 碳源中，含蔗糖的培養基發酵結果最好，含淀粉的培 養基次之，而含葡萄糖的培養基中產膠極低。分析原 因，很可能是過高的還原糖濃度會抑制黃單孢菌的生 長，所以，在葡萄糖為碳源的培養基中出現產膠低的 現象。

此外，黃單孢菌具有較強的胞外淀粉酶活性，使 之能夠邊水解底物邊加以利用，不會使發酵液中的還原 糖濃度過高。而蔗糖較淀粉更易水解，從而使菌體能 較快地生長，最終提高發酵結果?？紤]到蔗糖價格比 淀粉高，如利用淀粉水解液做為碳源，則既可利于菌 體的生長，又能不產生抑制。故試驗首先對發酵培養 基的DE值進行了考察。

利用淀粉酶水解淀粉，考察了不同水解時間下， 不同DE值對產膠的影響，分別以發酵液終粘度和產膠 率做為考察指標，試驗結果見表1。從表中可以看出， 淀粉水解20min后，DE值為32. 5%,所得的水解液做為 碳源經發酵后，發酵結果最佳，發酵液終粘度為 lOlOOc.p,產膠率2. 81%。

表1不同DE值對發酵的影響

Table 1 Effect of DE on fermentation

時間(h)0102030405060

DE值026.532.536.441.441.341.2

粘度(103cp)7.838.1410.18.207.407.407.43

產膠率(%)2.382.562.812.672.142.202.20

同時看到，水解時間的進一步增加反而造成了發酵 結果的下降。這也進一步表明：經適當水解的淀粉液因 含有適量的還原糖，使得培養基能更好地使菌體生長來 提高發酵結果，但過高的還原糖濃度會對菌體產生不利 的影響。

2.2 黃原膠分批補料的正交試驗

分批補料的發酵過程中，影響發酵結果的因素很 多，主要包括：培養基起始碳源的濃度、補料培養基 的組成、補料的開始時間及補料的方式等等。在前面 試驗的基礎上，安排正交試驗考察了各因素的影響情況

及尋找較優的工藝條件。試驗安排如表2

表2L9(34)正交設計因素和水平

Table 2 Factors and levels of orthogonal design L9(34)

水平A

起始碳源濃度(%)B

補料培養基C

補料開始時間(h)D

補料方式

12a24一次全加

23b36恒速流加

34c48指數流加

表中碳源均采用淀粉水解液，補料開始時間分別考 察了發酵培養24、36、48h后開始補料的不同時刻。補 料方式分三種情況，一次全加指在補料開始時，一次 加入剩余的培養基；黃原膠補料分批發酵工藝的試驗研究，恒速補料是從開始補料時刻，每隔 16h均勻加入等體積的補料培養基；指數補料是每隔16h 采用指數流加的方式加入補料培養基。補料過程控制總 糖為6%，發酵時間96h。分別以發酵液終粘度和產膠 率為考察指標進行了 L9 (34)正交試驗，結果分別見表3和 表4。

由這兩個正交試驗可以看出，培養基的起始濃度、 補料起始時間、補料培養基成分和補料方式等不同因素 對黃原膠的合成有不同程度的影響。

首先，在表3中可以看到，各因素對發酵液終粘 度的影響順序分別為：起始碳源濃度>補料開始時間> 補料方式>補料培養基。

表3 發醇液粘度的正交試驗結果

Table 3Experimental results of broth viscosity

序號ABCD粘度(cp)

12a24一次全加9050

22b36恒速流加8900

32c48指數流加8360

43a36指數流加10025

53b48一次全加9450

63c24恒速流加9800

74a48恒速流加8907

84b24指數流加10333

94c36一次全加9967

M1j26310279822918328467

M2j29275286832889227607

M3j29207281272671728718

m1j87709327.397279489

m2j9758.395619630.79202.3

m3j9735.79375.78905.79572.7

Rj988.3233.7821.3370.4

在表4中，各因素對產膠率的影響順序分別為：補 料方式 > 起始碳源濃度 > 補料培養基 > 補料起始時間。

從試驗結果看到，各因素對發酵液終粘度和產膠率 的影響是不完全一致的，這也從另一方面說明了，黃 原膠發酵的復雜性，發酵液終粘度高并不能說明產膠率 就高，而產膠率高的發酵液粘度也不一定很高。究其 原因，這和黃原膠本身分子量的大小及質量有關。所

表4產膠率的正交試驗結果

Table 4 Experimental results of yield of xanthan gum

序號ABCD 產膠率(%)

12a24一次全加1.79

22b36恒速流加1.9

32c48指數流加2.5

43a36指數流加2.13

53b48一次全加1.53

63c24恒速流加2.13

74a48恒速流加2.08

84b24指數流加2.55

94c36一次全加2.11

M1j6.1966.475.43

M2j5.795.986.146.11

M3j6.746.746.117.18

m1j2.0622.161.81

m2j1.931.992.052.04

M3j2.252.252.042.4

Rj0.320.2570.1230.59

以，應當對黃原膠的發酵結果綜合考慮。通過上述正

交試驗結果，得出了對黃原膠生產合成最有利的兩種排

列，并對兩種排列進行驗證試驗，結果如表5°

表5驗證試驗結果

Table 5Validation of the experimental results

序號AB CD粘度(cp) 產膠率(%)

13b 24指數流加110002.6

24c 24指數流加121503.01

從驗證試驗，可以看出試驗2的結果較為理想，最 終可以確定該工藝條件為正交試驗的最終結果。起始碳 源濃度為4%的淀粉水解液，因其含有適量的還原糖可 以更快地促進菌體生長，另外，高的C/N (碳氮比）利于 產膠，能使黃原膠盡快積累[3]。

補料起始時間從發酵培養24h后開始為最佳，這主 要是因為黃原膠的合成為典型的Gaden II型。在24h前 內主要為菌體生長期，菌體在該階段己經達到了最大 值，而24h后主要為產物合成期，所以在24h后補料不 僅滿足了菌體維持生長的需要，而且為快速合成黃原膠 提供了合成的原料。過晚補料，很可能會造成部分菌 體養料的缺乏而衰老，所以發酵24h后補料效果最好。

從補料培養基的成分看，適量氮源的加入不僅有利 于發酵液的粘度，而且有利于最終的產膠率。這表明， 氮源的補加，對后期的黃原膠的合成有促進作用。

補料方式的影響很明顯，不管從發酵液粘度還是產 膠率看，指數補加方式是最為有效的方式，采用一次 性大量補料方法雖然操作簡便，但這種方式會使將發酵 液瞬時大量稀釋。擾亂菌體的生理代謝，同時難于控 制過程處在最適合的狀態。采取恒速流加的方法，雖 然也比較簡單，但同樣不能保證菌體處于合適的狀態。 由于菌體生長和合成隨時間的非線性變化，采用指數補

料具有一定的優越性。

2.3 分批補料發酵與間歇發酵的動力學比較

在不同的發酵工藝條件下，通過分析動力學指標， 可以更加清晰地看出兩種工藝的差別。

圖2分批補料發酵菌體濃度和總糖濃度變化趨勢

Fig.2 Trend of biomass concentration and total sugar concentra¬tion in fed-batch fermentation

圖1和圖2分別表示了不同工藝條件下菌體濃度和

總糖濃度隨發酵時間的變化規律。二者的變化趨勢基本 相同。黃原膠補料分批發酵工藝的試驗研究，但分批補料的最大菌體濃度為1.15g/L，要高于 間歇發酵的菌體濃度l.〇8g/L。此外，由于分批補料前 期的總糖濃度較間歇發酵的低，因此，前期的C/N要 低，而較低的C/N比更加有利于菌體的生長，因此24h 前的菌體生長速度要快于間歇發酵。發酵24h后，間歇 發酵的菌體對總糖的得率系數Yx/S為0. 068,而分批補料 的菌體對總糖的得率系數Yx/S為0.074。所以，可以看 出，采取補料的方式對菌體的生長速度和生長量都有一 定的促進作用。

圖3給出了補料發酵和間歇發酵兩種工藝條件下， 發酵液粘度與產膠率隨時間的變化趨勢。通過比較可以 看到，在發酵前期，兩種工藝條件下的發酵液粘度增 長基本一致，但后期，補料的發酵液粘度持續增長。

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