黃原膠是由野油菜黃單胞桿菌（Xanthomonas campestris)以碳水化合物為主要底物發酵而產生的 酸性胞外雜多糖，為米白色或淺米黃色粉末，具有高 黏度、耐高溫、抗鹽堿及抗剪切等獨特的理化性質， 而且無色、無味、無毒、食用安全、易溶于水，在水溶液中呈多聚陰離子。因此，黃原膠被廣泛用于石油 開采、食品醫藥、陶瓷等輕化工領域[1-2]。野油菜黃 單胞桿菌為革蘭氏陰性好氧菌，它在發酵過程中由 于黃原膠的產生而使菌液變得十分黏稠[3]，發酵液 溶氧量下降，菌體的生長受到限制，導致產量降低。

　　

　　透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla Hemo globin，VHb ) 是透明顫菌（Vitreoscilla )在貧氧環境下誘導產生的 原核細胞中的血紅蛋白基因，由146個氨基酸組成，相對 分子量15 775[4-5]。透明顫菌血紅蛋白通過增加氧 流向細胞色素末端氧化酶的量，來提高細胞內氧濃 度[6]，它能夠從分子水平上提高菌體對氧氣的利用 能力。目前，透明顫菌血紅蛋白基因（ugb)已經被成 功克隆到多種微生物體內，并得到了表達[7-10]。

　　

　　為了利用ugb基因的優良特性對生產菌株進行 遺傳改造，本研究旨在將含有Ugb的重組質粒pUC- LV，轉入野油菜黃單胞桿菌中，研究ugb基因的導入 對黃原膠生成的影響。

　　

　　1材料與方法1.1材料1.1.1菌種和質粒野油菜黃單胞桿菌（Xan- thomonas campestris)W12菌株，本實驗室保存，無氨 芐抗性;質粒pUC -LV，本實驗室構建，含有570 bp 的ugb基因。

　　

　　1.1.2培養基LB培養基，見參考文獻[11]再 生培養基及搖瓶試驗培養基，見參考文獻[12 ]。 1.1.3原生質體制備用溶液SMM溶液5 mol/L 蔗糖,0.02 mol/L 順丁烯二酸,0.02mol/LMga2• 6H20, pH 6. 5; 4倍濃度的PAB溶液:牛肉膏1. 5 g/ L，酵母粉1. 5 g/L; SMMP溶液:4倍濃度的PAB溶 液和2倍濃度的SMM溶液等體積混合。高滲溶液:0.5 mol/L 蔗糖。

　　

　　1.2方法1.2.1質粒的提取和純化采用文獻[11]的方法。

　　

　　1.2.2 黃單胞桿菌原生質體的制備采用文獻 [13]中的方法。

　　

　　1.2.3黃單胞桿菌原生質體電轉化取制備好的 原生質體200 !L加入10 !L質粒，混勻后，將其放 入電擊杯中，冰浴5 min。然后，使用LN-101基因 脈沖導入儀進行電擊，將電容設為20 pF，電壓設為1.8 kV,電轉化完成后,將原生質體懸浮液倒入離心 管中，再加入800 !L高滲溶液，28C搖床 150r/min,培養1.5~2h。涂布于完全再生培養基 培養48 h后，將其相對應的影印到含有氨芐西林鈉 的LB平板上，于28C培養2 ~3 d，觀察轉化菌的生 長情況。

　　

　　1.2.4黃單胞桿菌轉化菌株的篩選菌體生長后， 再挑取長勢較好的單菌落接到含有相同氨芐濃度的 10 mL的LB液體培養基中，在相應溫度下，振蕩培 養，再次篩選長勢較好的菌體進行隨后的試驗。

　　

　　1.2. 5轉化菌株的鑒定取100 !L菌液10 000 r/ min,離心2 min,棄上清液，加等體積TE,沸水中煮 10 min以該菌液為模板，PCR擴增[14]。

　　

　　1.2.6搖瓶發酵及產膠量的測定參照文獻[12] 中的方法。

　　

　　2結果與分析2.1黃單胞桿菌的電轉化條件采用20 !F的電容，電壓在0.6 ~ 2.5 kV之間的轉化條件，對黃單胞桿菌原生質體進行電擊轉化 表1)。

　　

　　由表1可見，只有20 !F電容，1.8 kV的轉化條件出現了大量的轉化菌，其他處理的轉化效率很 低。這可能是在原生質體電擊轉化的過程中，由于 膜被局部擊穿，形成一些瞬時的孔洞，這些孔洞的大 小足以讓質粒DNA分子進入細胞，從而達到對受體 進行外源DNA轉化的目的。而一些更高的電壓造 成原生質體大批量的死亡，致使不能在再生培養基 上再生出細胞壁，也無法將外源DNA轉入。

　　

　　表1黃單胞桿菌原生質體電轉化條件 Table 1 Condition of electroporation for protoplasm of Xanthomonas序號Serial number電容/!FElectriccapacity電壓/kV Voltage時間/ms Time轉化效率Transformationefficiency1200.61.274-2200.81.118-3201.01.512-4201.21.503-5201.51.076+6201.81.586+ +7202. 01.366+8202. 21.024-9202.50. 896-注“-”代表轉化效率很低，幾乎沒有轉化子；“+”代表轉化 效率適中，有一些轉化子;“ + +"代表轉化效率很高，有大量的轉化 子.

　　

　　2.2 黃單胞桿菌轉化菌株的篩選挑選500個轉化菌，在10 mL LB液體培養基 (含氨芐西林鈉0. 1 mg/mL)中初篩出50個轉化菌， 進行搖瓶發酵復篩。結果，篩選出的W1、W2、W3、 W4和W5與初發菌株相比，菌落形態相同（圖1)。

　　

　　試驗結果表明，通過原生質體電轉化的方法，可 以成功得到轉化菌，轉化菌具有氨芐抗性。

　　

　　2.3轉化菌株的PCR鑒定PCR擴增結果顯示，所獲得的轉化菌株與含有 透明顫菌血紅蛋白基因的質粒pUC-LV的PCR結 果一致，都具有570 bp的基因片段，而初發菌沒有 擴增出相應的條帶，表明透明顫菌血紅蛋白基因 ugb轉入了黃單胞桿菌中。PCR電泳圖譜如圖2。

　　

　　2.4轉化菌株黃原膠產量的測定結果以W12為對照，分別對轉化菌株W1、W2、W3、 W4和W5進行搖瓶發酵試驗，比較初發菌株和轉化 菌株的增長量。增長量=(轉化菌的干重-W12的 干重)/ W12的干重，結果見表2。

　　

　　由表2可以看到，轉化菌搖瓶發酵產生的黃原 膠均比初發菌的高，最高可達到2. 96 g/100g，增加 了近22. 19%,平均增加了 15. 91%,表明透明顫菌 血紅蛋白基因Ugb的導入有利于黃原膠的合成，增 加了轉化菌的黃原膠產量。

　　

　　表2轉化菌株的黃原膠產量Table 2 Yield of Xanthan gum of Xanthomonas transforments菌株Strains黃原膠產量（g*100g-1)

　　

　　Yield of xanthan gum增加量/%Increasing amountW122.42-W12. 8115.97W22. 8316.83W32. 7915.18W42. 9622.19W52. 659. 403結論與討論黃單胞桿菌多糖的生物合成是由多個酶參與代 謝調節的結果，產膠基因是1個約16 kb彼此毗鄰 的基因簇，以此為受體菌構建工程菌提高產量比較 困難[15]。一些學者在對該菌進行遺傳改造時均采 用三親本接合法[15-17]。本研究通過原生質體電轉 化的方法，將含有ugb基因的質粒pUC-LV轉入到 黃單胞桿菌中，通過PCR擴增，檢測到轉化菌中含 有外源基因Ugb，表明本研究利用原生質體電轉化 法得到了黃單胞桿菌的轉化菌，這種方法與三親本 接合法相比簡單易行，同時也為外源基因導入黃單 胞桿菌提供一個便捷、有效的方法。

　　

　　溶氧在黃原膠發酵中有著非常重要的作用，通 常發酵液中的溶氧濃度影響到黃單胞桿菌的生長速 率、黃原膠的生成率以及黃原膠的質量，因此，加強 菌體的氧代謝水平對黃原膠的生成具有促進作用。 郭宏秋等[18]報道ugb基因轉入受體菌后，可以提高 轉化菌體的自身攝氧能力。本研究將ugb基因轉入 黃單胞桿菌中，搖瓶試驗表明，轉化菌的黃原膠產量 比初發菌平均提高了 15. 91%，說明ugb基因的導入 有利于黃原膠的合成。