黃原膠是經(jīng)發(fā)酵X程生產的一種用途廣泛的 微生物胞外多糖。在食品、石油、醫(yī)藥、日用化工 等十幾個領域有著極其廣泛的應用降解菌。黃原膠超 常的穩(wěn)定性極大地擴展了其應用范圍，但在應用 過程中其黏度過高也帶來一些問題，如在提高采 油率的同時也增加后繼工藝如原料運輸及產品的 成本[2]。同時黃原膠的降解產物寡糖還具有抗病 毒、抑菌、誘導植物抗性、提高免疫力等功能，可進 —步開發(fā)利用。因此，找到能高效降解黃原膠的 微生物菌株有著生產應用的潛在價值[3]。
1材料與方法
1.1菌種來源
從土壤和水中分離篩選出1株具較強降解能 力的黃原膠降解菌，該菌能夠以黃原膠為唯一碳 源進行生長，并具有黃原膠降解酶活性。
1.2藥品
工業(yè)級黃原膠、甘露糖、魔芋粉、葡萄糖、檸檬 酸、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、二甲基 氨基苯甲酸、溴百里酚藍、溴甲酚紫、瓊脂粉、結 晶紫、草酸銨、Na2 HP04、K2 HPC^、KH2 P04、 NH4 Cl、MnS()4、ZnS04、MgSO“ CuS04、FeS()4、 CaCl2、NaCl、Na2S04、NaOH，其它化學試劑均為 分析純 1.3培養(yǎng)基
1.3.1選擇性培養(yǎng)基（g^L1) 黃原膠5g， NH4C1 6 g,Na2HPO,5 g,NaH2P04 5 g„
1.3.2種子液培養(yǎng)基（g.L1〉 葡萄糖5g， NH4C1 6 g，Na2HP()45 g,NaH2P04 5 g，微量元 素液4 mL。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g-L1)黃原膠5g，NH4Cl 6 g，K2HF04 5 g，KH2P04 5 g,微量元素液 4 mL。
1.3.4微量元素液（mg*L-1) ZnS04 0. 1 mg, CuS04 0.1 mg,MnS04 0.1 mg»MgSO40.1 m^510 1.4儀器與設備
752紫外可見光分光光度計（南京第四分析 儀器有限公司）;CF 16RX高速冷凍離心機（日本 HITACHI公司）；ZNN-D6A型六速旋轉黏度 儀(青島海通達專用儀器廠h 1.5方法
1.5.1菌種篩選將所取土樣懸浮于滅菌后的 生理鹽水中，進行梯度稀釋，常規(guī)方法涂布黃原膠 平板，3CTC培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑單個菌落于選擇 性培養(yǎng)基中劃線，經(jīng)過培養(yǎng)，再從中挑選單個菌落 接種于新的選擇性培養(yǎng)基中，反復操作至菌種完 全純化，然后接種于斜面培養(yǎng)基中4SC保存w。 1.5.2粗酶液制備將菌種接種到含100 mL 種子液培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，3(TC 160 r«min_1 振蕩培養(yǎng)，5 000 r*min_l 離心 10 min 收集菌體。用無菌生理鹽水洗滌菌體3次，調整 細胞濃度1〇8個•mL'制成種子液。
在500 mL三角瓶中裝200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基， 按接種量1%接人種子液，3(TC 160 i-min1振蕩 培養(yǎng)24 h 5 000 r*min_l離心10 min，上清液即粗 酶液。
1.5.3醉活測定還原糖標準曲線的繪制方法 為:分別在水解管中加入〇. 5 g*I^的Glucose標 準溶液〇、5、10、30和40 pL，用雙蒸水補至 200 PL,向其中各加150 jiL PAHBAH溶液， 600 NaOH(5%)溶液，混勻，12(TC 加熱 15 min，用酶標儀測定OD<1)5w。
甘露聚糖酶活力測定方法:將一定量粗酶液 與0. 25%黃原膠水溶液混合，30°C水浴反應
45 min,立即取200 ML反應液加到750 fxL 5% PAHBAH和5%Na()H的混合液中，12(TC加熱 15 min,用酶標儀測定OQ。.,。
黃原膠降解酶的活力定義為每分鐘催化形成 相當于1 pmol葡萄糖的還原末端所需的酶量為 一個酶活力單位[9]。
1.5.4不同氮源對菌種產酶的影響用不同氮 源(含氮量終濃度為〇. 2%)代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的 NH4C1，研究各氮源如蛋白胨、胰蛋白胨、甘氨酸、 尿素、硝酸銨、磷酸氫二銨和氯化銨對產酶的影 響，取對數(shù)生長期的菌種接種于上述培養(yǎng) 基中[1°]。
1.5.5不同磷源對菌種產酶的影響分別以 NaH2P04，卩-甘油磷酸鈉或者ATP(含磷量的終 濃度為0.22%)作為唯一磷源，其它元素按發(fā)酵 培養(yǎng)液配方，取對數(shù)生長期的菌種接種于上述培 養(yǎng)基中[11]。
1.5.6酶學性質JP3最適pH及其穩(wěn)定性：在 pH 4. 0?9. 0的緩沖液（pH 4. 0?6. 5為 0.05 mol.L1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 7.0? 8.0為0.05 mo卜L1 \3只？04屮3私？04緩沖液; pH 9. 0為0. 05 mol. L1的甘氨酸-NaOH緩沖 液）中，測定酶活力[12]。
粗酶液與不同pH的緩沖液（pH 9. 0?10. 5 為0.05 mobL1碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液）于30'C 保溫6 h后，測定酶活力。
最適溫度和溫度穩(wěn)定性:將反應體系于不同 溫度測定酶活力，研究酶的最適溫度。將酶液在 不同溫度下保溫30 min后測定酶活力，分析酶的 溫度穩(wěn)定性。
金屬離子對酶活的影響：在不同金屬離 子(Cu2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Na+、Ca2+ 等）存在 時測定酶活(最適溫度，最適pH),以未添加金屬 離子的酶活作為空白對照（100%)，除Na+為 150 mmobU外，其余的金屬離子濃度皆為IX 10'3mol»L'1[13] „
米氏常數(shù)：以不同濃度的黃原膠作底物，測定 酶活力，計算酶反應的初速度。每個樣品做3次 平行測定，通過反應初速度和底物濃度的倒數(shù)作 圖，得到雙倒數(shù)圖。根據(jù)直線在X軸和Y軸的截 距，利用米氏方程可得米氏常數(shù)Km和最大反應 速度 Vmax[14]。..
底物濃度對酶活性的影響：底物濃度分別為 0.5%、1.0%、1.5%時發(fā)酵液菌體生長隨時間的 變化規(guī)律，搖瓶裝量為30 mL，初始pH為7. 0,接 種量為1. 0%，搖速為200 r.min-1。
42
1.5.7降黏率采用PAHBAH法測定黏度。 按比例接菌種于300 mL無菌液體培養(yǎng)基，調節(jié) pH后，測量初始表觀黏度V。，記錄測量溫度T。， 放置恒溫搖床培養(yǎng)一段時間后取出，水浴加熱或 自然冷卻，使溶液溫度恢復為r。，迅速測量表觀 黏度V,，繼續(xù)放置搖床培養(yǎng)觀察。用旋轉黏度儀 測量黏度，則降黏率為：W/% = (V。一 W)/ V〇 X 100115]«,
2結果與分析
2.1菌種的采集和分離及篩選
經(jīng)對反復篩選和培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液粘度下降 程度和速度的比較，選出1株對黃原膠降解能力 最強的菌落，命名為X08a。菌株X08a為細菌，在 生長過程中呈桿狀，老齡菌為球形，菌體形態(tài)不規(guī) 則；不形成孢子，革蘭氏染色陽性[16]。
2.2菌株X08a黃原膠酶酶活測定
酶標儀測定〇?40 fxg葡萄糖繪制標準曲 線(見圖1)，得直線方程:V=0.022 7z+0.074 6。
圖1還原糖標準曲線
由圖2可知，隨培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基的粘 度迅速下降，黃原膠降解酶活力逐漸上升，二者幾 乎同步變化，說明X08a菌生長過程中分泌胞外 降解酶將黃原膠降解，提供生長所需能量。
由圖3結果可知，以NH4C1作為氮源時，菌 體酶活力最高。氯化銨來源廣，價格低，是理想
氮源。
250
圖3不同氮源對X08a黃原膠酶產嗨的影響
2.4 不同磷源對菌株X08a黃原膠酶產酶的 彩響
圖4表明，以Na2HP04、(3-甘油磷酸鈉或者 ATP作唯一磷源時，甘露聚糖酶活性都隨磷源濃 度的增加而逐漸增高。Na2HP04更有利于菌株 X08a生長和產酶。
2.5X08a黃原膠酶釀學性質的測定
圖5表明，該酶最適pH范圍為5?6。菌株 X08a產酶期間以1 h為時間間隔，分別在不同 pH條件下測其酶活，可看出3條曲線間距不大， 即不同時間點的黃原膠酶在相同pH條件下的酶 活差別不大，說明在相同pH條件下這種酶產生 的時間長短對其酶活影響較小。
圖6 X08a黃原膠酶的最適溫度 對酶活幾乎無影響。說明該酶含有金屬離子，該 金屬離子可能是酶的直接活性中心，也可能是作
為輔基起到輔助性作用（見圖7)。
100
迄80 瀘60 « 40 20
圖7金屬離子對X08a黃原膠酶酶活的影響
根據(jù)計算，米氏常數(shù)Km=0.24最
大反應速度Vmax=68pmo卜（min*g)_l。表明這 種酶的反應速率與酶的濃度成正比(見圖8)。
°3456789 it)
pH
ffl5 X08a黃原膠酶的最適pH
圖6表明，這種酶最適溫度為30?40°C。菌 株X08a產酶期間以1 h為時間間隔，分別在不同 溫度下測其酶活，3條曲線的數(shù)值差別較大，即在 不同時間點的黃原膠酶在相同溫度下的酶活差別 較大，說明在相同溫度下這種酶產生的時間長短 對其酶活有較大影響。I‘
金屬離子Na+、Ca2+和EDTA均顯著降低酶 活。Mg2'Zn2+對酶活有抑制作用，Cu2+、Mn2+
表1表明，底物濃度在1%時，黃原膠酶活性 最高。
表1底物濃度對產醮的彩響
培養(yǎng)時間/h1.50%底物濃度
2.6降黏率
由圖9可知.隨時間變化，黃原膠溶液的黏度 逐漸下降，第1天黏度下降32%，第2天變化較
小，第3天有明顯下降，之后黏度緩慢下降。黃成 棟等研究表明，黃原膠分子的降解有主鏈降解和 側鏈降解2個過程。主鏈降解對黃原膠的黏度變 化影響較側鏈大，但側鏈的存在阻礙了主鏈的 降解。
圖9黃原膠溶液降黏率的變化情況
3結論與討論
'該試驗分離出了1株產黃原膠降解酶的細菌 菌株X08a,單位時間內對黃原膠有較高降粘率。 研究發(fā)現(xiàn)細菌X08a分泌的黃原膠降解酶對溫度 敏感性較高，對pH要求則相對寬松；通過金屬離 子對酶活性影響，推測有二價的主族金屬離子作 為輔助因子對酶的活性起作用；通過酶反應初速 度（V)與底物濃度（S)之間的關系可知這種酶的 底物專一性較強。而由該酶降解黃原膠所得到的 寡糖的結構、組成以及可能擁有的生物活性，則有 待進一步研究。